Takk for at du besøker www.chinacdoe.com.Nettleserversjonen du bruker har begrenset CSS-støtte.For den beste opplevelsen anbefaler vi at du bruker en oppdatert nettleser (eller deaktiverer kompatibilitetsmodus i Internet Explorer).I mellomtiden, for å sikre fortsatt støtte, vil vi gjengi nettstedet uten stiler og JavaScript.
Lab-on-a-chip-systemer med funksjoner på stedet tilbyr potensialet for rask og nøyaktig diagnose og er nyttige i ressursbegrensede omgivelser der biomedisinsk utstyr og trente fagfolk ikke er tilgjengelig.Det er imidlertid fortsatt en stor utfordring å lage et testsystem som samtidig har alle nødvendige funksjoner for multifunksjonell dispensering, utgivelse på forespørsel, pålitelig ytelse og langtidslagring av reagenser.Her beskriver vi en spakaktivert mikro-reisebryterteknologi som kan manipulere væsker i alle retninger, gi presis og proporsjonal respons på påført lufttrykk og forbli stabil mot plutselige bevegelser og vibrasjoner.Basert på teknologien beskriver vi også utviklingen av et polymerasekjedereaksjonssystem som integrerer reagensintroduksjon, blanding og reaksjonsfunksjoner i én prosess, som oppnår "prøve-i-svar-ut" ytelse for alle kliniske neseprøver fra 18 pasienter med Influensa og 18 individuelle kontroller, i god overensstemmelse med fluorescensintensiteten med standard polymerasekjedereaksjon (Pearson-koeffisienter > 0,9).Basert på teknologien beskriver vi også utviklingen av et polymerasekjedereaksjonssystem som integrerer reagensintroduksjon, blanding og reaksjonsfunksjoner i én prosess, som oppnår "prøve-i-svar-ut" ytelse for alle kliniske neseprøver fra 18 pasienter med influensa og 18 individuelle kontroller, i god overensstemmelse med fluorescensintensiteten med standard polymerasekjedereaksjon (Pearson-koeffisienter > 0,9).Оновываяс на этой технолиии, ы ии Введения реагентов, сешивания и реации в оном процесе, чче »и» и и и и и и и и ч ч п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п п чAL линичесих оразцов из носа от 18 пациентов с рип (og 18 отдельных контролей, в хорошем соответствии интенсивности флуоресценции со стандартной полимек фициенты Пирсона> 0,9).Basert på denne teknologien beskriver vi også utviklingen av et polymerasekjedereaksjonssystem som kombinerer funksjonene til å injisere, blande og reagere i en enkelt prosess, som muliggjør prøve-i-respons-ut for alle kliniske neseprøver fra 18 influensapasienter.og 18 individuelle kontroller, i god overensstemmelse med standard polymerasekjedereaksjons fluorescensintensitet (Pearsons koeffisienter > 0,9).Basert på denne teknologien beskriver vi også utviklingen av et polymerasekjedereaksjonssystem som integrerer reagensinjeksjon, blanding og reaksjonsfunksjoner for å analysere alle kliniske neseprøver fra 18 nesepasientprøver i prøven. Influensa og 18 individuelle kontroller, fluorescensintensitet matchet godt med standard polymerasekjedereaksjon (Pearsons koeffisient > 0,9).Den foreslåtte plattformen garanterer pålitelig automatisering av biomedisinsk analyse og kan dermed akselerere kommersialiseringen av en rekke testenheter.
Fremvoksende menneskelige sykdommer, som 2020 COVID-19-pandemien som har tatt livet av millioner av mennesker, utgjør en alvorlig trussel mot global helse og menneskelig sivilisasjon1.Tidlig, rask og nøyaktig oppdagelse av sykdommer er avgjørende for å kontrollere spredningen av viruset og forbedre behandlingsresultatene.Et kjernediagnostisk økosystem basert på sentraliserte laboratorier der testprøver sendes til sykehus eller diagnostiske klinikker og drives av fagfolk, begrenser for tiden tilgangen for nesten 5,8 milliarder mennesker over hele verden, spesielt de som bor i ressursbegrensede omgivelser.hvor det mangler dyrt biomedisinsk utstyr og kvalifiserte spesialister.klinikere 2. Det er derfor et presserende behov for å utvikle et billig og brukervennlig lab-on-a-chip-system med mulighet for punkt-av-omsorgstesting (POCT) som kan gi klinikere rettidig diagnostisk informasjon for å ta informerte diagnosebeslutninger .og behandling 3.
Verdens helseorganisasjons (WHO) retningslinjer sier at en ideell POCT bør være rimelig, brukervennlig (enkel å bruke med minimal trening), nøyaktig (unngå falske negative eller falske positive), rask og pålitelig (gi gode repeterbarhetsegenskaper), og leveringsdyktig (i stand til langtidslagring og lett tilgjengelig for sluttbrukere)4.For å oppfylle disse kravene må POCT-systemer gi følgende funksjoner: allsidig dosering for å redusere manuell intervensjon, reagenstransport etter behov for nøyaktige testresultater og pålitelig ytelse for å motstå miljøvibrasjoner.For øyeblikket er den mest brukte POCT-enheten den laterale strømningsstrimmelen5,6 som består av flere lag med porøse nitrocellulosemembraner som skyver en svært liten mengde prøve fremover, og reagerer med pre-immobiliserte reagenser ved kapillærkraft.Selv om de har fordelen av lave kostnader, brukervennlighet og raske resultater, kan strømningsstrimmelbaserte POCT-enheter bare brukes til biologiske tester (f.eks. glukosetester7,8 og graviditetstester9,10) uten å kreve flertrinnsanalyser.reaksjoner (f.eks. lasting av flere reagenser, blanding, multipleksing).I tillegg gir ikke drivkreftene som kontrollerer væskebevegelse (dvs. kapillærkrefter) god konsistens, spesielt mellom batcher, noe som resulterer i dårlig reproduserbarhet11 og gjør sidestrømsbånd primært nyttige for god deteksjon12,13.
Utvidede produksjonsevner på mikro- og nanoskala har skapt muligheter for utvikling av mikrofluidiske POCT-enheter for kvantitative målinger14,15,16,17.Ved å justere egenskapene til grensesnittet 18, 19 og geometrien til kanalene 20, 21, 22, kan kapillærkraften og strømningshastigheten til disse enhetene kontrolleres.Imidlertid forblir deres pålitelighet, spesielt for svært fuktede væsker, uakseptabel på grunn av unøyaktigheter i produksjonen, materialfeil og følsomhet for miljøvibrasjoner.I tillegg, siden en kapillærstrøm dannes ved væske-gass-grensesnittet, kan ingen ytterligere strøm introduseres, spesielt etter å ha fylt mikrofluidkanalen med væske.Derfor, for mer kompleks deteksjon, må flere trinn med prøveinjeksjon utføres24,25.
Blant mikrofluidenheter er sentrifugale mikrofluidenheter for tiden en av de beste løsningene for POCT26,27.Dens drivmekanisme er fordelaktig ved at drivkraften kan styres ved å justere rotasjonshastigheten.Ulempen er imidlertid at sentrifugalkraften alltid er rettet mot den ytre kanten av enheten, noe som gjør det vanskelig å implementere flertrinnsreaksjonene som kreves for mer komplekse analyser.Selv om ytterligere drivkrefter (f.eks. kapillærer 28, 29 og mange andre 30, 31, 32, 33, 34, 35) i tillegg til sentrifugalkraften introduseres for multifunksjonell dosering, kan uforutsett væskeoverføring fortsatt forekomme fordi disse tilleggskreftene generelt er ordrer. av størrelse lavere enn sentrifugalkraften, noe som gjør dem bare effektive over små driftsområder eller ikke tilgjengelige på forespørsel med væskeutløsning.Innlemming av pneumatiske manipulasjoner i sentrifugale mikrofluidikk som sentrifugalkinetiske metoder 36, 37, 38, termopneumatiske metoder 39 og aktive pneumatiske metoder 40 har vist seg å være et attraktivt alternativ.Med den kontrafugodynamiske tilnærmingen er et ekstra hulrom og tilkoblingsmikrokanaler integrert i enheten for både ekstern og intern handling, selv om pumpeeffektiviteten (i området fra 75 % til 90 %) er svært avhengig av antall pumpesykluser og viskositeten av væsken.I den termopneumatiske metoden er lateksmembranen og væskeoverføringskammeret spesielt utformet for å forsegle eller gjenåpne innløpet når det innestengte luftvolumet varmes opp eller avkjøles.Oppvarmings-/avkjølingsoppsettet introduserer imidlertid problemer med langsom respons og begrenser bruken i termosensitive analyser (f.eks. polymerasekjedereaksjon (PCR) amplifikasjon).Med en aktiv pneumatisk tilnærming oppnås utløsing og bevegelse innover etter behov gjennom samtidig påføring av positivt trykk og nøyaktig tilpassede rotasjonshastigheter av høyhastighetsmotorer.Det er andre vellykkede tilnærminger som kun bruker pneumatiske aktuatorer (positivt trykk 41, 42 eller undertrykk 43) og normalt lukkede ventildesign.Ved suksessivt å påføre trykk i det pneumatiske kammeret, pumpes væsken peristaltisk fremover, og den normalt lukkede ventilen hindrer tilbakestrømning av væske på grunn av peristaltikk, og realiserer dermed komplekse væskeoperasjoner.Imidlertid er det foreløpig bare et begrenset antall mikrofluidteknologier som kan utføre komplekse væskeoperasjoner i en enkelt POCT-enhet, inkludert multifunksjonell dispensering, utgivelse på forespørsel, pålitelig ytelse, langtidslagring, håndtering av høyviskositetsvæsker, og kostnadseffektiv produksjon.Alt på samme tid.Mangelen på en flertrinns funksjonell operasjon kan også være en av grunnene til at bare noen få kommersielle POCT-produkter som Cepheid, Binx, Visby, Cobas Liat og Rhonda har blitt introdusert på det åpne markedet til dags dato.
I denne artikkelen foreslår vi en pneumatisk mikrofluidisk aktuator basert på grønn ring mikrobryterteknologi (FAST).FAST kombinerer alle nødvendige egenskaper samtidig for et bredt spekter av reagenser fra mikroliter til milliliter.FAST består av elastiske membraner, spaker og blokker.Uten påføring av lufttrykk kan membranene, spakene og blokkene lukkes tett og væsken inni lagres i lang tid.Når passende trykk påføres og justeres til lengden på spaken, utvider membranen seg og skyver spaken til åpen posisjon, slik at væske kan passere gjennom.Dette tillater multifunksjonell måling av væsker i en kaskade, samtidig, sekvensiell eller selektiv måte.
Vi har utviklet et PCR-system som bruker FAST for å generere respons-i-prøve-resultater for påvisning av influensa A- og B-virus (IAV og IBV).Vi oppnådde en nedre deteksjonsgrense (LOD) på 102 kopier/ml, multipleksanalysen vår viste spesifisitet for IAV og IBV og tillot influensaviruspatotyping.De kliniske testresultatene ved bruk av neseprøven fra 18 pasienter og 18 friske individer viser god samsvar i fluorescensintensitet med standard RT-PCR (Pearson-koeffisienter > 0,9).De kliniske testresultatene ved bruk av neseprøven fra 18 pasienter og 18 friske individer viser god samsvar i fluorescensintensitet med standard RT-PCR (Pearson-koeffisienter > 0,9).Результаты клинических испытаний с использованием образца мазка из носа от 18 пациентов и 18 пациентов и 18 доковых оответствие интенсивности флуоресценции стандартной ОТ-ПЦР (коэффициенты Пирсона > 0,9).Resultatene av kliniske studier med en neseprøve fra 18 pasienter og 18 friske individer viser god samsvar mellom fluorescensintensiteten til standard RT-PCR (Pearsons koeffisienter > 0,9).0,9）。。... Результаты клинических испытаний с использованием образцов назальных мазков от 18 пациентов и 18 пациентов и 18 ползовац тветствие между интенсивностью флуоресценции и стандартной ОТ-ПЦР (коэффициент Пирсона > 0,9).Resultatene fra kliniske studier med neseprøver fra 18 pasienter og 18 friske individer viste god samsvar mellom fluorescensintensitet og standard RT-PCR (Pearsons koeffisient > 0,9).Den estimerte materialkostnaden for en FAST-POCT-enhet er ca. USD 1 (tilleggstabell 1) og kan reduseres ytterligere ved å bruke storskala produksjonsmetoder (f.eks. sprøytestøping).Faktisk har FAST-baserte POCT-enheter alle nødvendige funksjoner påbudt av WHO og er kompatible med nye biokjemiske testmetoder som plasma termisk syklus44, amplifikasjonsfrie immunoassays45 og nanobody-funksjonaliseringstester46 som er ryggraden i POCT-systemer.mulighet.
På fig.1a viser strukturen til FAST-POCT-plattformen, som består av fire væskekamre: et forlagringskammer, et blandekammer, et reaksjonskammer og et avfallskammer.Nøkkelen til kontroll av væskestrøm er RASK design (bestående av elastiske membraner, spaker og blokker) plassert i forhåndslagringskammeret og blandekammeret.Som en pneumatisk aktivert metode gir FAST-designen presis væskestrømskontroll, inkludert lukket/åpen svitsj, allsidig dosering, væskeutløsning på forespørsel, pålitelig drift (f.eks. ufølsomhet for miljøvibrasjoner) og langtidslagring.FAST-POCT-plattformen består av fire lag: et baksidelag, et elastisk filmlag, et plastfilmlag og et dekklag, som vist i forstørret snitt i fig. 1b (også vist i detalj i tilleggsfigurene S1 og S2 ).Alle kanaler og væsketransportkamre (som forlagrings- og reaksjonskamre) er innebygd i PLA (polymelkesyre)-substrater fra 0,2 mm (tynneste del) til 5 mm tykke.Det elastiske filmmaterialet er en 300 µm tykk PDMS som lett utvider seg når lufttrykk påføres på grunn av dens "tynne tykkelse" og lave elastisitetsmodul (ca. 2,25 MPa47).Polyetylenfilmlaget er laget av polyetylentereftalat (PET) med en tykkelse på 100 µm for å beskytte den elastiske filmen mot overdreven deformasjon på grunn av lufttrykk.Tilsvarende kamrene har substratlaget spaker koblet til dekklaget (laget av PLA) med hengsler for å kontrollere flyten av væske.Den elastiske filmen ble limt til underlagssjiktet med dobbeltsidig klebende tape (ARseal 90880) og dekket med en plastfilm.Tre lag ble satt sammen på et underlag ved bruk av en T-clip-design i dekklaget.T-klemmen har et gap mellom to ben.Da klipsen ble satt inn i sporet, bøyde de to bena seg litt, og returnerte deretter til sin opprinnelige tilstand og bandt lokket og baksiden tett mens de passerte gjennom sporet (tilleggsbilde S1).De fire lagene settes deretter sammen ved hjelp av koblinger.
Skjematisk diagram av plattformen som illustrerer de ulike funksjonelle rommene og funksjonene til FAST.b Forstørret diagram av FAST-POCT-plattformen.c Bilde av plattformen ved siden av en amerikansk kvart dollarmynt.
Arbeidsmekanismen til FAST-POCT-plattformen er vist i figur 2. Nøkkelkomponentene er blokkene på basislaget og hengslene på dekklaget, noe som resulterer i en interferensdesign når de fire lagene settes sammen med en T-form .Når det ikke påføres lufttrykk (fig. 2a), forårsaker interferenspasningen at hengslet bøyes og deformeres, og en tetningskraft påføres gjennom spaken for å presse den elastiske filmen mot blokken, og væsken i tetningshulrommet defineres. som en forseglet tilstand.Det skal bemerkes at i denne tilstanden er spaken bøyd utover, som vist i sideriss i fig. 2a.Når luft tilføres (fig. 2b), utvider den elastiske membranen seg utover mot dekselet og skyver spaken opp, og åpner dermed en spalte mellom spaken og blokken slik at væske kan strømme inn i neste kammer, som er definert som en åpen tilstand .Etter frigjøring av lufttrykket kan spaken gå tilbake til sin opprinnelige posisjon og forbli stram på grunn av elastisiteten til hengslet.Videoer av spakens bevegelser er presentert i tilleggsfilmen S1.
A. Skjematisk diagram og fotografier når lukket.I fravær av trykk presser spaken membranen mot blokken, og væsken forsegles.b I god stand.Når det påføres trykk, utvider membranen seg og skyver spaken opp, slik at kanalen åpnes og væske kan strømme.c Bestem den karakteristiske størrelsen på det kritiske trykket.Karakteristiske dimensjoner inkluderer lengden på spaken (L), avstanden mellom glideren og hengslet (l) og tykkelsen på spakens fremspring (t).Fs er komprimeringskraften ved gasspunkt B. q er den jevnt fordelte belastningen på spaken.Tx* representerer dreiemomentet utviklet av den hengslede spaken.Kritisk trykk er trykket som kreves for å heve spaken og få væsken til å strømme.d Teoretiske og eksperimentelle resultater av sammenhengen mellom kritisk trykk og elementstørrelse.n = 6 uavhengige eksperimenter ble utført og data er vist som ± standardavvik.Rådata presenteres som rådatafiler.
En analytisk modell basert på stråleteorien er utviklet for å analysere avhengigheten av det kritiske trykket Pc som gapet åpner ved på de geometriske parameterne (for eksempel er L lengden på spaken, l er avstanden mellom blokken og hengsel, S er spaken. Kontaktområdet med væsken t er tykkelsen på spakens fremspring, som vist i fig. 2c).Som beskrevet i tilleggsmerknadene og tilleggsfiguren S3, åpnes gapet når \({P}_{c}\ge \frac{2{F}_{s}l}{SL}\), hvor Fs er dreiemomentet \ ({T}_{x}^{\ast}(={F}_{s}l)\) for å eliminere kreftene forbundet med en interferenspasning og få hengslet til å bøye seg.Den eksperimentelle responsen og den analytiske modellen viser god samsvar (fig. 2d), og viser at det kritiske trykket Pc øker med økende t/l og synkende L, noe som lett kan forklares med den klassiske bjelkemodellen, dvs. dreiemomentet øker med t /Lift .Dermed viser vår teoretiske analyse tydelig at det kritiske trykket effektivt kan kontrolleres ved å justere spaklengden L og t/l-forholdet, noe som gir et viktig grunnlag for utformingen av FAST-POCT-plattformen.
FAST-POCT-plattformen gir multifunksjonell dispensering (vist i figur 3a med innsetting og eksperiment), som er den viktigste egenskapen til vellykket POCT, der væsker kan strømme i alle retninger og i hvilken som helst rekkefølge (kaskade, samtidig, sekvensiell) eller selektiv multikanal utlevering .– doseringsfunksjon.På fig.3a(i) viser en kaskadedelt doseringsmodus hvor to eller flere kamre er kaskadekoblet ved bruk av blokker for å skille de forskjellige reaktantene og en spak for å kontrollere den åpne og lukkede tilstanden.Når det påføres trykk, strømmer væsken fra det øvre til det nedre kammeret på en kaskade måte.Det skal bemerkes at kaskadekamrene kan fylles med våte kjemikalier eller tørre kjemikalier som lyofilisert pulver.I eksperimentet i fig. 3a(i) flyter det røde blekket fra det øvre kammeret sammen med det blå fargepulveret (kobbersulfat) inn i det andre kammeret og blir mørkeblått når det når det nedre kammeret.Den viser også kontrolltrykket for væsken som pumpes.På samme måte, når en spak er koblet til to kamre, blir den samtidig injeksjonsmodus, som vist i fig.3a(ii), hvor væsken kan fordeles jevnt over to eller flere kamre når trykk påføres.Siden det kritiske trykket avhenger av lengden på spaken, kan lengden på spaken justeres for å oppnå et sekvensielt injeksjonsmønster som vist i fig.3a(iii).En lang spak (med kritisk trykk Pc_long) ble koblet til kammer B og en kort spak (med kritisk trykk Pc_short > Pc_long) ble koblet til kammer A. Ettersom trykk P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) ble påført, ble bare væsken i rødt kan strømme til kammer B og når trykket ble økt til P2 (> Pc_short), kan den blå væsken strømme til kammer A. Denne sekvensielle injeksjonsmodusen gjelder for forskjellige væsker som overføres til deres relaterte kamre i rekkefølge, noe som er avgjørende for en vellykket POCT enhet.En lang spak (med kritisk trykk Pc_long) ble koblet til kammer B og en kort spak (med kritisk trykk Pc_short > Pc_long) ble koblet til kammer A. Ettersom trykk P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) ble påført, ble bare væsken i rødt kan strømme til kammer B og når trykket ble økt til P2 (> Pc_short), kan den blå væsken strømme til kammer A. Denne sekvensielle injeksjonsmodusen gjelder for forskjellige væsker som overføres til deres relaterte kamre i rekkefølge, noe som er avgjørende for en vellykket POCT enhet.Длинный рычаг (с критическим давлением Pc_long) был соединен с камерой B, а короткий рычаг (с критическим Pc_long) инен с камерой A. При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) только жидкость, выделенная красным может камеру B, и когда давление было увеличено до P2 (> Pc_short), синяя жидкость может течь в камеру камеру может камеру а применяется к различным жидкостям, последовательно перемещаемым в соответствующие камеры, чето имеще шной POCT.En lang spak (med kritisk trykk Pc_long) ble koblet til kammer B, og en kort spak (med kritisk trykk Pc_short > Pc_long) ble koblet til kammer A. Når trykk P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) påføres, er bare væsken uthevet i rødt kan strømme inn i kammer B, og når trykket er økt til P2 (> Pc_short), kan den blå væsken strømme inn i kammer A. Denne sekvensielle injeksjonsmodusen brukes på forskjellige væsker sekvensielt overført til de respektive kamrene, noe som er kritisk for vellykket POCT.enhet. Orde рой A.Den lange armen (kritisk trykk Pc_long) er koblet til kammer B og den korte armen (kritisk trykk Pc_short > Pc_long) er koblet til kammer A.При приложении давления P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) в камеру B может поступать только красная жидкость, а_Pc_short в камеру ort) в камеру A может поступать синяя жидкость.Når trykk P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) påføres, kan kun rød væske komme inn i kammer B, og når trykket økes til P2 (> Pc_short), kan blå væske komme inn i kammer A. Denne sekvensielle injeksjonsmodusen er egnet for sekvensiell overføring av forskjellige væsker inn i de respektive kamrene, noe som er avgjørende for vellykket drift av POCT-enheten.Figur 3a(iv) viser den selektive injeksjonsmodusen, hvor hovedkammeret hadde en kort (med kritisk trykk Pc_short) og en lang spak (med kritisk trykk Pc_long < Pc_short) som var koblet til henholdsvis kammer A og kammer B i tillegg. til en annen luftkanal koblet til kammer B. For å overføre væsken til kammer A først, ble trykk P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) og P2 (P2 > P1) med P1 + P2 > Pc_short påført enheten samtidig.Figur 3a(iv) viser den selektive injeksjonsmodusen, hvor hovedkammeret hadde en kort (med kritisk trykk Pc_short) og en lang spak (med kritisk trykk Pc_long < Pc_short) som var koblet til henholdsvis kammer A og kammer B i tillegg. til en annen luftkanal koblet til kammer B. For å overføre væsken til kammer A først, ble trykk P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) og P2 (P2 > P1) med P1 + P2 > Pc_short påført enheten samtidig.På fig.3а(iv) показан режим селективного впрыска, при котором основная камера имела короткий (с критическим давын) (med критическим давлением Pc_long < Pc_short), которые дополнительно соединялись с камерой A og камерой B соответстветствет.3a(iv) viser den selektive injeksjonsmodusen, hvor hovedkammeret hadde en kort (med kritisk trykk Pc_short) og en lang spak (med kritisk trykk Pc_long < Pc_short), som i tillegg var koblet til henholdsvis kammer A og kammer B.камерой вали давление P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) og P2 (P2 > P1), где P1 + P2 > Pc_short.til en annen luftkanal koblet til kammer B. For først å overføre væske til kammer A, ble trykk P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) og P2 (P2 > P1) påført enheten samtidig, hvor P1 + P2 > Pc_short. 3а (iv) показан режим селтивного впрыа, кога освная ый стержень (сритичесим давлением pc_long <pc_short), соединенные памеей и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и и min з зном канал, подключенному к комнате B.3a(iv) viser den selektive injeksjonsmodusen når hovedkammeret har en kort stamme (kritisk trykk Pc_short) og en lang stamme (kritisk trykk Pc_long < Pc_short) koblet til henholdsvis kammer A og kammer B, og i tillegg til en annen luftpassasje, koblet til rom B.Dermed forhindrer P2 at væske kommer inn i kammer B;i mellomtiden overskred det totale trykket P1 + P2 det kritiske trykket for å aktivere den kortere spaken koblet til kammer A for å tillate væskestrøm til kammer A. Så, når kammer B måtte fylles, trenger vi bare å bruke P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) i hovedkammeret for å aktivere den lange spaken og la væsken strømme til kammer B. Det kan tydelig observeres fra tiden t = 3 s til 9 s at væsken i kammer A holdt seg konstant mens den økte i kammeret B når trykk P1 ble påført.i mellomtiden overskred det totale trykket P1 + P2 det kritiske trykket for å aktivere den kortere spaken koblet til kammer A for å tillate væskestrøm til kammer A. Så, når kammer B måtte fylles, trenger vi bare å bruke P1 (Pc_long < P1 < Pc_short) i hovedkammeret for å aktivere den lange spaken og la væsken strømme til kammer B. Det kan tydelig observeres fra tiden t = 3 s til 9 s at væsken i kammer A holdt seg konstant mens den økte i kammeret B når trykk P1 ble påført.Межение P1 + P2 превыио о о о, о о о о о о A, чтоы позволить жидости тч в камеру A. затем, kort ) i основной камере, чтобы активировать длинный рычаг и дать жидкости течь в камеру B. Можно ясно 3 av til 9 med жидкость в камере En оставалась постоянной, в то время как в камере på увеличивалась.I mellomtiden har det totale trykket P1 + P2 overskredet det kritiske trykket for å aktivere en kortere spak koblet til kammer A for å la væske strømme inn i kammer A. Så når kammer B må fylles, trenger vi bare å bruke P1 (Pc_long < P1 < Pc_short ) i hovedkammeret for å aktivere den lange spaken og la væsken strømme inn i kammer B. Det kan tydelig observeres at mellom t = 3 s og 9 s holdt væsken i kammer A seg konstant, mens den i kammer økte.B når trykk P1 påføres.Samtidig overskrider det totale trykket P1 + P2 det kritiske trykket, og aktiverer den kortere spaken som forbinder kammer A, slik at væske strømmer inn i kammer A.Når det er på tide å fylle kammer A, påfører vi ganske enkelt P1 i hovedkammeret og P2 i sekundærkammeret.På denne måten kan flytoppførselen selektivt byttes mellom kamera A og B. Flytoppførselen til de fire multifunksjonelle distribusjonsmodusene finner du i tilleggsfilmen S2.
a Illustrasjon av multifunksjonell tilordning, dvs. (i) kaskade, (ii) samtidig, (iii) sekvensiell og (iv) selektiv tilordning.Kurvene representerer arbeidsflyten og parameterne for disse fire distribusjonsmodusene.b Resultater av langtidslagringstester i avionisert vann og etanol.n = 5 uavhengige eksperimenter ble utført og data er vist som ± sd c.Stabilitetstest demonstrasjoner når FAST-enheten og kapillærventilen (CV)-enheten var i (i) statisk og (ii) vibrerende tilstand.(iii) Volum vs. tid for FAST- og CV-enheter ved forskjellige vinkelfrekvenser.d Publisering av testresultater på forespørsel for (i) FAST-enhet og (ii) CV-enhet.(iii) Forholdet mellom volum og tid for FAST- og CV-enheter som bruker intermitterende trykkmodus.Alle målestokker, 1 cm.Rådata leveres som rådatafiler.
Langtidslagring av reagenser er en annen viktig egenskap ved en vellykket POCT-enhet som vil tillate utrent personell å håndtere flere reagenser.Mens mange teknologier har vist sitt potensial for langtidslagring (f.eks. 35 mikrodispensere, 48 blisterpakninger og 49 pinnepakker), kreves det et dedikert mottaksrom for å romme pakken, noe som øker kostnadene og kompleksiteten;videre tillater ikke disse lagringsmekanismene dispensering på forespørsel og resulterer i sløsing med reagenser på grunn av rester i emballasjen.Langtidslagringsevne ble verifisert ved å utføre en akselerert levetidstest ved bruk av CNC-maskinert PMMA-materiale på grunn av dets svake ruhet og motstand mot gassgjennomtrengning (tilleggsfigur S5).Testapparatet ble fylt med avionisert vann (avionisert vann) og 70 % etanol (simulering av flyktige reagenser) ved 65°C i 9 dager.Både avionisert vann og etanol ble lagret ved bruk av aluminiumsfolie for å blokkere tilgang ovenfra.Arrhenius-ligningen og penetrasjonsaktiveringsenergien rapportert i litteraturen50,51 ble brukt til å beregne sanntidsekvivalenten.På fig.3b viser gjennomsnittlig vekttapsresultater for 5 prøver lagret ved 65°C i 9 dager, tilsvarende 0,30% for avionisert vann og 0,72% for 70% etanol over 2 år ved 23°C.
På fig.3c viser vibrasjonstesten.Siden kapillærventilen (CV) er den mest populære væskehåndteringsmetoden blant eksisterende POCT28,29-enheter, ble en CV-enhet 300 µm bred og 200 µm dyp brukt for sammenligning.Det kan sees at når begge enhetene forblir stasjonære, tetter væsken i FAST-POCT-plattformen og væsken i CV-enheten låser seg på grunn av den plutselige utvidelsen av kanalen, noe som reduserer kapillærkreftene.Imidlertid, ettersom orbitalvibratorens vinkelfrekvens øker, forblir væsken i FAST-POCT-plattformen forseglet, men væsken i CV-enheten strømmer inn i det nedre kammeret (se også tilleggsfilm S3).Dette antyder at de deformerbare hengslene til FAST-POCT-plattformen kan påføre en sterk mekanisk kraft på modulen for å lukke væsken i kammeret tett.Men i CV-enheter holdes væske tilbake på grunn av balansen mellom de faste, luft- og væskefasene, noe som skaper ustabilitet, og vibrasjoner kan forstyrre balansen og forårsake uventet strømningsatferd.Fordelen med FAST-POCT-plattformen er at den gir pålitelig funksjonalitet og unngår feil ved tilstedeværelse av vibrasjoner som vanligvis oppstår under levering og drift.
En annen viktig funksjon ved FAST-POCT-plattformen er dens on-demand-utgivelse, som er et nøkkelkrav for kvantitativ analyse.På fig.3d sammenligner on-demand-utgivelsen av FAST-POCT-plattformen og CV-enheten.Fra fig.3d(iii) ser vi at FAST-enheten reagerer raskt på trykksignalet.Når trykk ble påført FAST-POCT-plattformen, strømmet væsken, når trykket ble sluppet stoppet strømmen umiddelbart (fig. 3d(i)).Denne handlingen kan forklares med den raske elastiske returen av hengslet, som presser spaken tilbake mot blokken, og lukker kammeret.Imidlertid fortsatte væske å strømme i CV-enheten, noe som til slutt resulterte i et uventet væskevolum på omtrent 100 µl etter at trykket ble sluppet (Figur 3d(ii) og Supplementary Movie S4).Dette kan forklares ved at den kapillære pinningseffekten forsvinner ved fullstendig fukting av CV-en etter den første injeksjonen.
Evnen til å håndtere væsker med varierende fuktbarhet og viskositet i samme enhet er fortsatt en utfordring for POCT-applikasjoner.Dårlig fuktbarhet kan føre til lekkasjer eller annen uventet strømningsatferd i kanalene, og hjelpeutstyr som virvelblandere, sentrifuger og filtre er ofte nødvendig for å tilberede høyviskøse væsker 52 .Vi testet forholdet mellom kritisk trykk og væskeegenskaper (med et bredt spekter av fuktbarhet og viskositet).Resultatene er vist i tabell 1 og video S5.Det kan ses at væsker med ulik fuktbarhet og viskositet kan forsegles i kammeret, og når det påføres trykk, kan selv væsker med en viskositet på opptil 5500 cP overføres til det tilstøtende kammeret, noe som gjør det mulig å oppdage prøver med høy viskositet (dvs. sputum, en svært tyktflytende prøve som brukes til diagnostisering av luftveissykdommer).
Ved å kombinere de ovennevnte multifunksjonelle dispenseringsenhetene kan et bredt utvalg av FAST-baserte POCT-enheter utvikles.Et eksempel er vist i figur 1. Anlegget inneholder et forlagringskammer, et blandekammer, et reaksjonskammer og et avfallskammer.Reagenser kan lagres i forhåndslagringskammeret i lengre perioder og deretter slippes ut i blandekammeret.Med riktig trykk kan de blandede reaktantene selektivt overføres til et avfallskammer eller et reaksjonskammer.
Fordi PCR-deteksjon er gullstandarden for å oppdage patogener som H1N1 og COVID-19 og involverer flere reaksjonstrinn, brukte vi FAST-POCT-plattformen for PCR-deteksjon som en applikasjon.På fig.4 viser PCR-testprosessen ved bruk av FAST-POCT-plattformen.Først ble elueringsreagenset, magnetisk mikroperlereagens, vaskeløsning A og vaskeløsning W pipettert inn i pre-lagringskamrene E, M, W1 og W2, henholdsvis.Stadiene av RNA-adsorpsjon er vist i fig.4a og er som følger: (1) når trykk P1 (=0,26 bar) påføres, beveger prøven seg inn i kammer M og slippes ut i blandekammeret.(2) Lufttrykk P2 (= 0,12 bar) tilføres gjennom port A koblet til bunnen av blandekammeret.Selv om en rekke blandemetoder har vist sitt potensial i å blande væsker på POCT-plattformer (f.eks. serpentinblanding 53, tilfeldig blanding 54 og batchblanding 55), er deres blandeeffektivitet og effektivitet fortsatt ikke tilfredsstillende.Den tar i bruk bobleblandingsmetoden, der luft introduseres i bunnen av blandekammeret for å lage bobler i væsken, hvoretter den kraftige virvelen kan oppnå fullstendig blanding i løpet av sekunder.Bobleblandingsforsøk ble utført og resultatene er presentert i tilleggsfigur S6.Det kan sees at når et trykk på 0,10 bar påføres, tar fullstendig blanding ca. 8 sekunder.Ved å øke trykket til 0,20 bar oppnås fullstendig blanding på ca. 2 sekunder.Metoder for beregning av blandingseffektivitet er presentert i metodedelen.(3) Bruk en rubidiummagnet for å trekke ut kulene, trykk deretter P3 (= 0,17 bar) gjennom port P for å flytte reagensene inn i avfallskammeret.På fig.4b,c viser vasketrinnene for å fjerne urenheter fra prøven som følger: (1) Vaskeløsningen A fra kammeret W1 slippes ut i trykkblandekammeret P1.(2) Utfør deretter bobleblandingsprosessen.(3) Vaskeløsningen A overføres til avfallsvæskekammeret, og mikroperlene i blandekammeret trekkes ut av magneten.Vasking W (fig. 4c) var lik vask A (fig. 4b).Det skal bemerkes at hvert vasketrinn A og W ble utført to ganger.Figur 4d viser elueringstrinnene for å eluere RNA fra kulene;eluerings- og blandingsintroduksjonstrinnene er de samme som RNA-adsorpsjons- og vasketrinnene beskrevet ovenfor.Når elueringsreagensene overføres til PCR-reaksjonskammeret under trykk P3 og P4 (=0,23 bar), nås det kritiske trykket for å forsegle armen til PCR-reaksjonskammeret.På samme måte hjelper P4-trykket også til å tette passasjen til avfallskammeret.Dermed ble alle elueringsreagenser jevnt fordelt mellom de fire PCR-reaksjonskamrene for å starte multiplekse PCR-reaksjonene.Prosedyren ovenfor er presentert i Supplementary Movie S6.
I RNA-adsorpsjonstrinnet introduseres prøven i innløpet M og injiseres i blandekammeret sammen med den tidligere lagrede perleløsningen.Etter blanding og fjerning av granulatene fordeles reagensene i avfallskammeret.b og c vasketrinn, introduser forskjellige forhåndslagrede vaskereagenser i blandekammeret, og etter blanding og fjerning av kulene, overfør reagensene til avfallsvæskekammeret.d Elueringstrinn: Etter innføring av elueringsreagensene, blanding og perleekstraksjon, overføres reagensene til PCR-reaksjonskammeret.Kurvene viser arbeidsflyten og relaterte parametere for de ulike stadiene.Trykk er trykket som utøves gjennom de enkelte kamrene.Volum er volumet av væske i blandekammeret.Alle målestokkene er 1 cm.Rådata leveres som rådatafiler.
En PCR-testprosedyre ble utført, og tilleggsfigur S7 viser termiske profiler inkludert 20 minutter med omvendt transkripsjonstid og 60 minutter med termisk syklustid (95 og 60 °C), med en termisk syklus på 90 s (tilleggsfilm S7)..FAST-POCT krever mindre tid for å fullføre én termisk syklus (90 sekunder) enn konvensjonell RT-PCR (180 sekunder for én termisk syklus).Dette kan forklares med det høye overflateareal til volumforhold og den lave termiske treghet i mikro-PCR-reaksjonskammeret.Kammeroverflaten er 96,6 mm2 og kammervolumet er 25 mm3, noe som gjør forholdet mellom overflate og volum ca. 3,86.Som vist i tilleggsfigur S10, har PCR-testområdet på plattformen vår et spor på bakpanelet, noe som gjør bunnen av PCR-kammeret 200 µm tykk.En termisk ledende elastisk pute er festet til varmeoverflaten til temperaturregulatoren, og sikrer tett kontakt med baksiden av testboksen.Dette reduserer plattformens termiske treghet og forbedrer varme-/kjøleeffektiviteten.Under termisk syklus smelter parafinen som er innebygd i plattformen og strømmer inn i PCR-reaksjonskammeret, og fungerer som et tetningsmiddel for å forhindre reagensfordampning og miljøforurensning (se tilleggsfilm S8).
Alle PCR-deteksjonsprosesser beskrevet ovenfor ble helautomatisert ved bruk av et spesiallaget FAST-POCT-instrument, bestående av en programmert trykkkontrollenhet, en magnetisk ekstraksjonsenhet, en temperaturkontrollenhet og en fluorescerende signalfangst- og prosesseringsenhet.Det er verdt å merke seg at vi brukte FAST-POCT-plattformen for RNA-isolering og brukte deretter de ekstraherte RNA-prøvene for PCR-reaksjoner ved å bruke FAST-POCT-systemet og desktop PCR-systemet for sammenligning.Resultatene var nesten de samme som vist i tilleggsfigur S8.Operatøren utfører en enkel oppgave: introduserer prøven i M-kammeret og setter plattformen inn i instrumentet.Kvantitative testresultater er tilgjengelige på omtrent 82 minutter.Detaljert informasjon om FAST-POCT-verktøy finner du i tilleggsfiguren.C9, C10 og C11.
Influensa forårsaket av influensa A (IAV), B (IBV), C (ICV) og D (IDV) virus er et vanlig globalt fenomen.Av disse er IAV og IBV ansvarlige for de alvorligste tilfellene og sesongmessige epidemier, som infiserer 5-15 % av verdens befolkning, forårsaker 3-5 millioner alvorlige tilfeller og forårsaker 290 000-650 000 dødsfall årlig.Luftveissykdommer56,57.Tidlig diagnose av IAV og IB er avgjørende for å redusere sykelighet og tilhørende økonomisk belastning.Blant tilgjengelige diagnostiske teknikker er revers transkriptase-polymerasekjedereaksjonen (RT-PCR) ansett som den mest sensitive, spesifikke og nøyaktige (>99 %)58,59.Blant tilgjengelige diagnostiske teknikker er revers transkriptase-polymerasekjedereaksjonen (RT-PCR) ansett som den mest sensitive, spesifikke og nøyaktige (>99 %)58,59.Среди доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (Рессиптазой (Русский) тельной, специфичной и точной (> 99%)58,59.Blant de tilgjengelige diagnostiske metodene er revers transkriptasepolymerasekjedereaksjon (RT-PCR) ansett som den mest sensitive, spesifikke og nøyaktige (> 99 %)58,59. Из доступных диагностических методов полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТеППЦЦР) льной, специфичной и точной (>99%)58,59.Av de tilgjengelige diagnostiske metodene er revers transkriptase-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) ansett som den mest sensitive, spesifikke og nøyaktige (>99 %)58,59.Tradisjonelle RT-PCR-metoder krever imidlertid gjentatt pipettering, blanding, dispensering og overføring av væske, noe som begrenser bruken av dem av fagfolk i ressursbegrensede omgivelser.Her ble FAST-POCT-plattformen brukt til PCR-deteksjon av henholdsvis IAV og IBV for å oppnå deres nedre deteksjonsgrense (LOD).I tillegg har IAV og IBV blitt multiplekset for å skille mellom ulike patotyper på tvers av arter, noe som gir en lovende plattform for genetisk analyse og evnen til å behandle sykdommen nøyaktig.
På fig.5a viser resultatene av HAV PCR-testing ved bruk av 150 ul renset viralt RNA som en prøve.På fig.5a(i) viser at ved en HAV-konsentrasjon på 106 kopier/ml kan fluorescensintensiteten (ΔRn) nå 0,830, og når konsentrasjonen reduseres til 102 kopier/ml kan ΔRn fortsatt nå 0,365, som tilsvarer høyere enn det av den tomme negative kontrollgruppen (0,002), omtrent 100 ganger høyere.For kvantifisering basert på seks uavhengige eksperimenter ble det generert en lineær kalibreringskurve mellom log-konsentrasjon og syklusterskel (Ct) for IAV (Fig. 5a(ii)), R2 = 0,993, varierende fra 102-106 kopier/ml.resultatene stemmer godt overens med konvensjonelle RT-PCR-metoder.På fig.5a(iii) viser fluorescerende bilder av testresultater etter 40 sykluser av FAST-POCT-plattformen.Vi fant ut at FAST-POCT-plattformen kan oppdage HAV så lavt som 102 kopier/ml.Den tradisjonelle metoden har imidlertid ikke en Ct-verdi på 102 kopier/ml, noe som gjør den til en LOD på omtrent 103 kopier/ml.Vi antok at dette kan skyldes den høye effektiviteten til bobleblanding.PCR-testeksperimenter ble utført på renset IAV RNA for å evaluere ulike blandingsmetoder, inkludert risteblanding (samme blandingsmetode som ved konvensjonell RT-PCR-operasjon), hetteglassblanding (denne metoden, 3 s ved 0,12 bar) og ingen blanding som kontrollgruppe ..Resultatene finnes i tilleggsfigur S12.Det kan sees at ved en høyere RNA-konsentrasjon (106 kopier/ml) er Ct-verdiene for de forskjellige blandemetodene nesten de samme som for bobleblanding.Når RNA-konsentrasjonen falt til 102 kopier/ml, hadde shakeblandingen og kontrollene ingen Ct-verdier, mens bobleblandingsmetoden fortsatt ga en Ct-verdi på 36,9, som var under Ct-terskelen på 38. Resultatene viser en dominerende blandingskarakteristikk. vesikler, som også er påvist i annen litteratur, noe som også kan forklare hvorfor følsomheten til FAST-POCT-plattformen er litt høyere enn konvensjonell RT-PCR.På fig.5b viser resultatene av PCR-analyse av rensede IBV RNA-prøver som varierer fra 101 til 106 kopier/ml.Resultatene var lik IAV-testen, og oppnådde en R2 = 0,994 og en LOD på 102 kopier/ml.
en PCR-analyse av influensa A-virus (IAV) med IAV-konsentrasjoner fra 106 til 101 kopier/ml ved bruk av TE-buffer som negativ kontroll (NC).(i) Sanntids fluorescenskurve.(ii) Lineær kalibreringskurve mellom logaritmisk IAV RNA-konsentrasjon og syklusterskel (Ct) for FAST og konvensjonelle testmetoder.(iii) IAV FAST-POCT fluorescerende bilde etter 40 sykluser.b, PCR-deteksjon av influensa B-virus (IBV) med (i) sanntidsfluorescensspektrum.(ii) Lineær kalibreringskurve og (iii) FAST-POCT IBV fluorescensbilde etter 40 sykluser.Den nedre deteksjonsgrensen (LOD) for IAV og IBV ved bruk av FAST-POCT-plattformen var 102 kopier/ml, som er lavere enn konvensjonelle metoder (103 kopier/ml).c Multipleks testresultater for IAV og IBV.GAPDH ble brukt som en positiv kontroll og TE-buffer ble brukt som en negativ kontroll for å forhindre mulig kontaminering og bakgrunnsforsterkning.Fire forskjellige prøvetyper kan skilles: (1) GAPDH-negative prøver (“IAV-/IBV-”);(2) IAV-infeksjon ("IAV+/IBV-") med IAV og GAPDH;(3) IBV-infeksjon ("IAV-/IBV+") med IBV og GAPDH;(4) IAV/IBV-infeksjon ("IAV+/IBV+") med IAV, IBV og GAPDH.Den stiplede linjen representerer terskellinjen.n = 6 biologisk uavhengige eksperimenter ble utført, data er vist som ± standardavvik.Rådata presenteres som rådatafiler.
På fig.5c viser resultatene av multipleksingstesten for IAV/IBV.Her ble viruslysat brukt som prøveløsning i stedet for renset RNA, og fire primere for IAV, IBV, GAPDH (positiv kontroll) og TE-buffer (negativ kontroll) ble tilsatt fire forskjellige reaksjonskamre på FAST-POCT-plattformen.Positive og negative kontroller brukes her for å forhindre mulig kontaminering og bakgrunnsforsterkning.Testene ble delt inn i fire grupper: (1) GAPDH-negative prøver ("IAV-/IBV-");(2) IAV-infisert (“IAV+/IBV-”) versus IAV og GAPDH;(3) IBV-.infisert (“IAV-”) -/IBV+”) IBV og GAPDH;(4) IAV/IBV ("IAV+/IBV+") infeksjon med IAV, IBV og GAPDH.På fig.5c viser at når negative prøver ble påført, var fluorescensintensiteten ΔRn til det positive kontrollkammeret 0,860, og ΔRn for IAV og IBV var lik den negative kontrollen (0,002).For gruppene IAV+/IBV-, IAV-/IBV+ og IAV+/IBV+ viste IAV/GAPDH-, IBV/GAPDH- og IAV/IBV/GAPDH-kameraene signifikant fluorescensintensitet, mens de andre kameraene til og med viste fluorescensintensitet i bakgrunnen nivå på 40 etter termisk sykling.Fra testene ovenfor viste FAST-POCT-plattformen enestående spesifisitet og tillot oss å patotype forskjellige influensavirus samtidig.
For å validere den kliniske anvendeligheten til FAST-POCT, testet vi 36 kliniske prøver (neseprøver) fra IB-pasienter (n=18) og ikke-IB-kontroller (n=18) (Figur 6a).Pasientinformasjon er presentert i tilleggstabell 3. IB-infeksjonsstatus ble uavhengig bekreftet og studieprotokollen ble godkjent av Zhejiang University First Affiliated Hospital (Hangzhou, Zhejiang).Hvert utvalg av pasienter ble delt inn i to kategorier.Den ene ble behandlet med FAST-POCT, og den andre ble behandlet ved hjelp av et PCR-system (SLAN-96P, Kina).Begge analysene bruker samme rense- og deteksjonssett.På fig.6b viser resultatene av FAST-POCT og konvensjonell revers transkripsjons-PCR (RT-PCR).Vi sammenlignet fluorescensintensiteten (FAST-POCT) med -log2(Ct), der Ct er syklusterskelen for konvensjonell RT-PCR.Det var god overensstemmelse mellom de to metodene.FAST-POCT og RT-PCR viste en sterk positiv korrelasjon med en Pearsons ratio (r) verdi på 0,90 (Figur 6b).Vi vurderte deretter den diagnostiske nøyaktigheten til FAST-POCT.Fluorescensintensitetsfordelinger (FL) for positive og negative prøver ble gitt som et uavhengig analytisk mål (fig. 6c).FL-verdier var signifikant høyere hos IB-pasienter enn hos kontroller (****P = 3,31 × 10-19; tosidet t-test) (fig. 6d).Deretter ble kurver for IBV-mottakerdriftskarakteristikk (ROC) plottet.Vi fant at den diagnostiske nøyaktigheten var meget god, med et område under kurven på 1 (fig. 6e).Vær oppmerksom på at på grunn av obligatorisk maskebestilling i Kina på grunn av COVID-19 fra og med 2020, har vi ikke identifisert pasienter med IBD, så alle positive kliniske prøver (dvs. neseprøver) var kun for IBV.
Design av klinisk studie.Totalt 36 prøver, inkludert 18 pasientprøver og 18 ikke-influensakontroller, ble analysert ved bruk av FAST-POCT-plattformen og konvensjonell RT-PCR.b Vurder den analytiske konsistensen mellom FAST-POCT PCR og konvensjonell RT-PCR.Resultatene var positivt korrelert (Pearson r = 0,90).c Fluorescensintensitetsnivåer hos 18 IB-pasienter og 18 kontroller.d Hos IB-pasienter (+) var FL-verdiene signifikant høyere enn i kontrollgruppen (-) (****P = 3,31 × 10-19; tosidet t-test; n = 36).For hvert kvadratisk plott representerer den svarte markøren i midten medianen, og den nederste og øverste linjen i boksen representerer henholdsvis 25. og 75. persentil.Værhårene strekker seg til minimums- og maksimumsdatapunktene, som ikke regnes som avvikere.e ROC-kurve.Den stiplede linjen d representerer terskelverdien estimert fra ROC-analysen.AUC for IBV er 1. Rådata leveres som rådatafiler.
I denne artikkelen presenterer vi FAST, som har egenskapene som kreves for en ideell POCT.Fordelene med teknologien vår inkluderer: (1) Allsidig dosering (kaskade, samtidig, sekvensiell og selektiv), frigjøring ved behov (rask og proporsjonal frigjøring av påført trykk) og pålitelig drift (vibrasjon ved 150 grader) (2) langtidslagring (2 år med akselerert testing, vekttap ca. 0,3%);(3) evnen til å arbeide med væsker med et bredt spekter av fuktbarhet og viskositet (viskositet opp til 5500 cP);(4) Økonomisk (estimert materialkostnad for FAST-POCT PCR-enheten er ca. USD 1).Ved å kombinere multifunksjonelle dispensere ble en integrert FAST-POCT-plattform for PCR-deteksjon av influensa A- og B-virus demonstrert og brukt.FAST-POCT tar bare 82 minutter.De kliniske testene med 36 nasale vattpinneprøver viste god samsvar i fluorescensintensitet med standard RT-PCR (Pearson-koeffisienter > 0,9).De kliniske testene med 36 nasale vattpinneprøver viste god samsvar i fluorescensintensitet med standard RT-PCR (Pearson-koeffisienter > 0,9).(Kliniske tester с 36 образцами мазков из носа показали хорошее соответствие интенсивности флуандисц эффициенты Пирсона > 0,9).Kliniske tester med 36 prøver av neseprøver viste god samsvar med fluorescensintensiteten til standard RT-PCR (Pearsons koeffisienter > 0,9). RT-PCR (Klinisk informasjon 36 образцов мазков из носа показали хорошее совпадение интенсивности флуоресанци эффициент Пирсона > 0,9).Klinisk testing av 36 neseprøver viste god overensstemmelse mellom fluorescensintensitet og standard RT-PCR (Pearsons koeffisient > 0,9).Parallelt med dette arbeidet har forskjellige nye biokjemiske metoder (f.eks. plasma termisk syklus, amplifikasjonsfrie immunanalyser og nanobody-funksjonaliseringsanalyser) vist sitt potensial i POCT.Men på grunn av mangelen på en fullt integrert og robust POCT-plattform, krever disse metodene uunngåelig separate forbehandlingsprosedyrer (f.eks. RNA-isolasjon44, incubation45 og washing46), som ytterligere utfyller dagens arbeid med disse metodene for å implementere avanserte POCT-funksjoner med de nødvendige parameterne.hent-i-svar-utdataytelse.I dette arbeidet, selv om luftpumpen som brukes til å aktivere FAST-ventilen er liten nok til å integreres i et benktoppinstrument (fig. S9, S10), bruker den fortsatt betydelig strøm og genererer støy.I prinsippet kan mindre formfaktor pneumatiske pumper erstattes med andre midler, for eksempel bruk av elektromagnetisk kraft eller fingeraktivering.Ytterligere forbedringer kan inkludere for eksempel å tilpasse sett for ulike og spesifikke biokjemiske analyser, ved å bruke nye deteksjonsmetoder som ikke krever varme-/kjølesystemer, og dermed gi en verktøyfri POCT-plattform for PCR-applikasjoner.Vi tror at gitt at FAST-plattformen gir en måte å manipulere væsker på, tror vi at den foreslåtte FAST-teknologien presenterer potensialet til å skape en felles plattform ikke bare for biomedisinsk testing, men også for miljøovervåking, matkvalitetstesting, material- og legemiddelsyntese ..
Innsamling og bruk av humane neseprøver er godkjent av etikkkomiteen ved Zhejiang University First Affiliated Hospital (IIT20220330B).36 neseprøver ble samlet inn, med 16 voksne < 30 år, 7 voksne > 40 år og 19 menn, 17 kvinner.36 neseprøver ble samlet inn, med 16 voksne < 30 år, 7 voksne > 40 år og 19 menn, 17 kvinner.Было собрано 36 образцов мазков из носа, в которых приняли участие 16 взрослых < 30 лет, 7 меслыш, 7 маслыш og 17 juni.Trettiseks neseprøver ble tatt fra 16 voksne < 30 år, 7 voksne over 40 år, 19 menn og 17 kvinner.Demografiske data er presentert i tilleggstabell 3. Informert samtykke ble innhentet fra alle deltakerne.Alle deltakerne ble mistenkt for å ha influensa og ble testet frivillig uten kompensasjon.
FAST-basen og lokket er laget av polymelkesyre (PLA) og skrevet ut av Ender 3 Pro 3D-printer (Shenzhen Transcend 3D Technology Co., Ltd.).Dobbeltsidig tape ble kjøpt fra Adhesives Research, Inc. modell 90880. PET-film 100 µm tykk ble kjøpt fra McMaster-Carr.Både limet og PET-filmen ble kuttet med Silhouette Cameo 2-kutteren fra Silhouette America, Inc. Den elastiske filmen er laget av PDMS-materiale ved sprøytestøping.Først ble en 200 µm tykk PET-ramme kuttet ved hjelp av et lasersystem og limt til et 3 mm tykt PMMA-ark med 100 µm dobbeltsidig klebende tape.PDMS-forløperen (Sylgard 184; Del A: Del B = 10:1, Dow Corning) ble deretter helt i formen og en glassstav ble brukt for å fjerne overflødig PDMS.Etter herding ved 70°C i 3 timer, kunne den 300 μm tykke PDMS-filmen skrelles av formen.
Bilder for allsidig distribusjon, on-demand publisering og pålitelig ytelse tas med et høyhastighetskamera (Sony AX700 1000 fps).Orbital shakeren som ble brukt i pålitelighetstesten ble kjøpt fra SCILOGEX (SCI-O180).Lufttrykket genereres av en luftkompressor, og flere digitale presisjonstrykkregulatorer brukes til å justere trykkverdien.Testprosessen for flytatferd er som følger.En forhåndsbestemt mengde væske ble injisert inn i testanordningen og et høyhastighetskamera ble brukt til å registrere strømningsoppførselen.Stillbilder ble deretter tatt fra videoer av strømningsatferden til faste tider, og det gjenværende området ble beregnet ved hjelp av Image-Pro Plus-programvaren, som deretter ble multiplisert med kameradybden for å beregne volumet.Detaljer om testsystemet for strømningsatferd finnes i tilleggsfigur S4.
Injiser 50 µl mikrokuler og 100 µl avionisert vann inn i hetteglassblandeanordningen.Bilder med blandet ytelse ble tatt med et høyhastighetskamera hvert 0,1 sekund ved trykk på 0,1 bar, 0,15 bar og 0,2 bar.Pikselinformasjon under blandingsprosessen kan hentes fra disse bildene ved hjelp av fotobehandlingsprogramvare (Photoshop CS6).Og blandeeffektivitet kan oppnås med følgende ligning 53.
hvor M er blandingseffektiviteten, N er det totale antallet prøvepiksler, og ci og \(\bar{c}\) er de normaliserte og forventede normaliserte konsentrasjonene.Blandingseffektiviteten varierer fra 0 (0 %, ublandet) til 1 (100 %, fullstendig blandet).Resultatene er vist i tilleggsfigur S6.
Sanntids RT-PCR-sett for IAV og IBV, inkludert IAV- og IBV RNA-prøver (kat. nr. RR-0051-02/RR-0052-02, Liferiver, Kina), Tris-EDTA buffer (TE buffer nr. B541019 , Sangon Biotech, Kina), RNA-rensesett for positiv kontroll (delnr. Z-ME-0010, Liferiver, Kina) og GAPDH-løsning (delnr. M591101, Sangon Biotech, Kina) er kommersielt tilgjengelige.RNA-rensesettet inkluderer en bindingsbuffer, vask A, vask W, elueringsmiddel, magnetiske mikrokuler og en akrylbærer.IAV og IBV sanntids RT-PCR-sett inkluderer IFVA nukleinsyre PCR-deteksjonsblanding og RT-PCR-enzym.Tilsett 6 µl AcrylCarrier og 20 µl magnetiske perler til 500 µl bindingsbufferløsning, rist godt og klargjør deretter perleløsningen.Tilsett 21 ml etanol til vask A og W, rist godt for å oppnå løsninger av henholdsvis vask A og W.Deretter ble 18 µl fluorescerende PCR-blanding med IFVA-nukleinsyre og 1 µl RT-PCR-enzym tilsatt til 1 µl TE-løsning, ristet og sentrifugert i flere sekunder, og oppnådd 20 µl IAV- og IBV-primere.
Følg følgende RNA-renseprosedyre: (1) RNA-adsorpsjon.Pipetter 526 µl av pelletløsningen inn i et 1,5 ml sentrifugerør og tilsett 150 µl prøve, rist deretter røret manuelt opp og ned 10 ganger.Overfør 676 µl av blandingen til affinitetskolonnen og sentrifuger ved 1,88 x 104 g i 60 sekunder.Påfølgende avløp kastes deretter.(2) Det første trinnet med vask.Tilsett 500 µl vaskeløsning A til affinitetskolonnen, sentrifuger ved 1,88 x 104 g i 40 s, og kast den brukte løsningen.Denne vaskeprosessen ble gjentatt to ganger.(3) den andre fasen av vask.Tilsett 500 µl vaskeløsning W til affinitetskolonnen, sentrifuger ved 1,88×104 g i 15 s og kast den brukte løsningen.Denne vaskeprosessen ble gjentatt to ganger.(4) Eluering.Tilsett 200 µl eluat til affinitetskolonnen og sentrifuger ved 1,88 x 104 g i 2 minutter.(5) RT-PCR: Eluatet ble injisert i 20 μl av primerløsningen i et PCR-rør, deretter ble røret plassert i et sanntids PCR-testapparat (SLAN-96P) for å utføre RT-PCR-prosessen.Hele deteksjonsprosessen tar omtrent 140 minutter (20 minutter for RNA-rensing og 120 minutter for PCR-deteksjon).
526 µl perleløsning, 1000 µl vaskeløsning A, 1000 µl vaskeløsning W, 200 µl eluat og 20 µl primerløsning ble foreløpig tilsatt og lagret i kammer M, W1, W2, E og PCR-deteksjonskammer.Plattformmontering.Deretter ble 150 µl av prøven pipettert inn i kammer M og FAST-POCT-plattformen ble satt inn i testinstrumentet vist i tilleggsfigur S9.Etter ca. 82 minutter var testresultatene tilgjengelige.
Med mindre annet er angitt, presenteres alle testresultater som gjennomsnitt ± SD etter minimum seks replikater ved bruk av kun FAST-POCT-plattformen og biologisk uavhengige prøver.Ingen data ble ekskludert fra analysen.Eksperimentene er ikke tilfeldige.Forskerne var ikke blinde for gruppeoppgaver under forsøket.
For mer informasjon om studiedesign, se naturforskningsrapporten som er knyttet til denne artikkelen.
Data som støtter resultatene av denne studien er tilgjengelig i tilleggsinformasjon.Denne artikkelen inneholder de originale dataene.
Chagla, Z. & Madhukar, P. COVID-19-boostere i rike nasjoner vil utsette vaksiner for alle.Chagla, Z. & Madhukar, P. COVID-19-boostere i rike nasjoner vil utsette vaksiner for alle.Chagla, Z. og Madhukar, P. COVID-19-boostere i rike land vil utsette vaksiner for alle.Chagla, Z. og Madhukar, P. COVID-19-revaksinering i rike land vil forsinke vaksinasjon for alle.Nasjonal medisin.27, 1659–1665 (2021).
Faust, L. et al.SARS-CoV-2-testing i lav- og mellominntektsland: tilgjengelighet og rimelighet i den private helsesektoren.mikrobiell infeksjon.22, 511–514 (2020).
Verdens helseorganisasjon.Global forekomst og forekomst av utvalgte helbredelige seksuelt overførbare infeksjoner: en gjennomgang og estimater.Genève: WHO, WHO/HIV_AIDS/2 https://apps.who.int/iris/bitstream/handle/10665/66818/WHO_HIV_AIDS_2001.02.pdf (2001).
Fenton, EM et al.Flere 2D-støpte teststrimler for sidestrøm.ASS søknad.alma mater.Inter Milan.1, 124–129 (2009).
Schilling, KM et al.Helt lukket mikrofluidisk papirbasert analyseenhet.anus.Kjemisk.84, 1579–1585 (2012).
Lapenter, N. et al.Konkurrerende papirbasert immunokromatografi kombinert med enzymmodifiserte elektroder muliggjør trådløs overvåking og elektrokjemisk bestemmelse av urin-kotinin.Sensorer 21, 1659 (2021).
Zhu, X. et al.Kvantifisere sykdomsbiomarkører med en allsidig nanozym-integrert lateral væskeplattform ved hjelp av et glukometer.biologisk sensor.Bioelektronikk.126, 690–696 (2019).
Boo, S. et al.Graviditetsteststrimmel for påvisning av patogene bakterier ved bruk av concanavalin A-human choriongonadotropin-Cu3(PO4)2 hybrid nanoblomster, magnetisk separasjon og smarttelefonavlesning.Mikrodatamaskin.Blad.185, 464 (2018).